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Faut-il un support rigide pour la formation d'un biofilm bactérien ?

Les biofilms qui se développent sur toute surface immergée sont d'un grand intérêt à plusieurs titres, mais les conditions de leur formation sont encore insuffisamment connues. La rigidité du substrat à coloniser par les bactéries est un des facteurs resté peu exploré jusqu'ici.

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 Les biofilms sont des communautés de micro-organismes adhérant entre eux et sur une surface. Ils se développent sur toutes les surfaces, en général en présence d'eau. Dans le milieu marin, ils permettent la colonisation des coques de navires, des canalisations et de tout objet immergé par des algues et des invertébrés qui sont une entrave à de nombreuses activités humaines : il est donc très important de comprendre les mécanismes impliqués dans leur mise en place. L'adhésion de bactéries en est la première étape ; elle résulte de l'interaction entre des forces attractives ou répulsives à différentes échelles et dépend de facteurs liés aux bactéries elles-mêmes, à l'environnement et au substrat. Parmi ces derniers, on a étudié l'impact de la composition chimique, du caractère hydrophobe, de la charge électrique et de la rugosité, mais celui de la rigidité (résistance à la déformation) reste mal connu. Ce travail étudie l'influence de celle-ci sur la rétention de deux bactéries constitutives des biofilms marins, une Pseudoalteromonas (souche D41) et un Bacillus (souche 4J6).

 Pour cela, elles ont été mises en contact avec deux substrats de rigidité différente, puis les bactéries non fixées ont été éliminées par rinçages pour permettre l'étude du biofilm. Les substrats sont des hydrogels à 0,75 et 3 % d'agarose, dont la rigidité dépend de la concentration. Différents tests ont permis de vérifier que les différences entre les deux gels ne proviennent que de leur rigidité, et non d'autres facteurs comme le poids moléculaire de l'agarose (qui affecte ses propriétés mécaniques), l'homogénéité des surfaces à l'échelle microscopique et macroscopique ou leurs paramètres thermodynamiques.

Pour les tests d'adhésion, le gel est ensemencé avec 20 ml d'une culture à 107 bactéries/ml ; après 3 heures d'incubation à 20°C, le gel est rincé 3 fois pour éliminer les bactéries non adhérentes. Cette procédure est répétée 3 fois pour chaque substrat avec des gels et des cultures indépendants.

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Les deux souches bactériennes (4J6 à gauche et D41 à droite) vues en microscopie électronique à balayage.

Après coloration de la culture, la disposition des bactéries adhérant à la surface du gel est observée par une  technique qui permet d'obtenir une représentation tridimensionnelle (microscopie confocale à balayage laser). Les gels sont ensuite broyés pour séparer les bactéries et les mettre en suspension, dont un extrait est mis en culture sur un milieu nutritif. Chaque bactérie se développe et donne naissance à une colonie : en comptant celles-ci après 48 heures de culture, on peut donc connaître le nombre de bactéries présentes dans l'extrait et en déduire le nombre de celles qui se sont fixées sur le gel d'agarose.

Enfin, une approche protéomique permet de caractériser les protéines qui ont été synthétisées dans chaque biofilm. Les protéines extraites des colonies sont séparées sur une plaque de gel (technique d'électrophorèse), où leur répartition est étudiée par analyse d'images. Les taches qu'elles forment sont détectées et quantifiées, puis la protéine correspondant à chacune d'entre elles est identifiée par des méthodes de chimie analytique (chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse).

 Les tests de mobilité ont montré que la souche D41 est mobile grâce à son flagelle alors que 4J6 n'est pas capable de nager dans les conditions de l'expérience. L'adhésion des bactéries sur les deux gels dépend de la souche : D41 adhère plus sur le gel à 3% d'agarose (135.000 par cm²) que sur le gel à 0,75% (35.000 par cm²) ; par contre, il n'y a pas de différence entre les gels pour 4J6 (34.000 par cm²). L'analyse d'images confirme ces résultats mais montre que le film bactérien de D41est homogène sur les deux gels alors que celui de 4J6 présente des amas de cellules sur le gel à 0,75% (mais pas sur l'autre).

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 Les films bactériens des deux souches sur les deux gels vus en microscopie (après coloration)

La comparaison protéomique entre les gels a été faite pour D41. L’électrophorèse bidimensionnelle produit en moyenne 120 taches, dont 22 présentent des différences significatives entre les deux gels. Les 21protéines identifiées par le séquençage sont impliquées dans les fonctions métaboliques primaires des cellules. L'une d'entre elles, de la famille des porines, est localisée dans la membrane extérieure ; par son exposition à la surface de la cellule, elle pourrait avoir un intérêt dans les processus d’adhésion à un support.

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Les taches formées par les protéines de D41 sur la plaque d'électrophorèse. Les marques blanches et grises indiquent respectivement les protéines significativement plus et moins abondantes dans le gel à 3% que dans celui à 0,75 %.

En raison de leur même ordre de grandeur de taille (0,5 à 3 µm), l'adhésion des bactéries sur une surface a d'abord été décrite avec des modèles physico-chimiques conçus pour des particules colloïdales. Mais cette approche est limitée, notamment parce que les bactéries ont des appendices (chaînes de polysaccharides, fibres protéiques) qui ont un rôle important de liaison entre cellules et avec le substrat.

Les résultats de cette étude mettent en évidence trois conclusions principales :

- les bactéries sont capables d'adhérer à un hydrogel d'agarose. Leur faible nombre confirme les faibles propriétés adhésives de ces gels ;

- la rigidité des hydrogels influence l'adhésion des bactéries, à travers le nombre de cellules et la morphologie du film ;

- les bactéries adaptent leur physiologie à la rigidité des hydrogels. 21 protéines, le plus souvent liées à des processus métaboliques clés, sont régulées de façon différentielle selon que D41 adhère à l'un ou l'autre gel. Une protéine de membrane externe est fortement impliquée, mais l'hypothèse selon laquelle elle pourrait jouer un rôle de capteur de surface nécessitera des études plus poussées.

 

L'article

Guégan C., Garderes J., Le Pennec G., Gaillard F., Fay F., Linossier I., Herry J.-M., Bellon Fontaine M.-N., Vallée Réhel K., 2014. Alteration of bacterial adhesion induced by the substrate stiffness. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 114 : 193– 200.

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Les auteurs

Ce travail résulte de la collaboration entre des membres du Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines (Lorient, laboratoire associé à l'IUEM), de la Plateforme Metabomer (Station biologique de Roscoff) et du laboratoire Micalis (Massy).

 

La revue

Publiée par Elsevier depuis 1993, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces est une revue internationale consacrée à la recherche fondamentale et appliquée sur les phénomènes colloïdaux et d'interfaces en relation aux systèmes d'origine biologique. Les articles qu'elle publie ont un intérêt particulier dans les domaines médical, pharmaceutique, biotechnologique, alimentaire et cosmétique.

 

Contacts

Auteurs : consulter l'annuaire de l'IUEM
Service Communication et médiation scientifique : communication.iuem@univ-brest.fr


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